zkumavky, stojan na zkumavky, kapátka (suchá)

roztoky tuků a olejů v organickém rozpouštědle (1,2-dichlorethanu, chloroformu) – máslo, sádlo, rostlinný tuk, řepkový a slunečnicový olej, extrakt z vaječného žloutku, acetanhydrid, konc. H₂SO₄

Postup pro tento pokus je dostupný jen pro registrované učitele.

Cholesterol je 27 uhlíkatá látka, která patří do skupiny steroidů (odvozené lipidy – isoprenoidy). Jeho základem je struktura steranu – cyklopentanoperhydrofenanthren. Cholesterol obsahuje v kruhu B dvojnou vazbu a –OH skupinu v poloze 3 na kruhu A – řadí se tedy do skupiny sterolů (steroidních alkoholů). Cholesterol je velice důležitý pro syntézu steroidních hormonů, žlučových kyselin a vitaminu D.

Liebermannův-Burchardův test dokazuje přítomnost cholesterolu, případně i dalších sterolů (fytosterolů) ve vzorcích tuků a olejů. Pozitivním výsledkem reakce je vznik zeleného, modrého, případně hnědého až červeného zbarvení. Vznik zeleného zbarvení při reakcích v přítomnosti cholesterolu je způsoben narušením cyklopentanoperhydrofenanthrenového skeletu molekuly a vznikem specifického produktu, který se projevuje právě zeleným zbarvením. Při vysoké koncentraci cholesterolu přechází zbarvení v temně zelené až tmavě modré (např. v případě vaječného žloutku). Hnědé zbarvení se většinou objevuje v případě důkazů fytosterolů v rostlinných tucích a olejích. Tento test tedy není specifický pouze na cholesterol.
Cholesterol (zoosterol – sterol živočišného původu) je obsažen jak v másle, tak i sádle i ve vaječném žloutku. Jako máslo lze definovat výrobek, který obsahuje minimálně 80 % tuků (většinou se průměrný obsah tuků pohybuje okolo 82 %). Máslo obsahuje cca 16 % vody – jedná se tedy o emulzi vody v tuku. Máslo obsahuje také cholesterol, který lze dokázat pomocí Liebermannova-Burchardova testu, a to průměrně 250 mg na 100 g másla. Oproti tomu sádlo je 100% tuk a obsahuje cca 1/3 cholesterolu v porovnání s máslem – průměrný obsah cholesterolu v sádle je cca 95 mg na 100 g sádla. Z tohoto důvodu má vzniklé zbarvení menší intenzitu u sádla než u másla (některá másla ovšem také neposkytují výrazné zelené zbarvení – neobsahují tedy velké množství cholesterolu). Vaječný žloutek obsahuje průměrně 1 120 mg cholesterolu na 100 g vaječného žloutku. Cholesterol je tedy významnou součástí vaječného žloutku, proto v extraktu cholesterol dokážeme vznikem tmavě zeleného až modrého zbarvení.
Fytosteroly (steroly rostlinného původu) se nachází v rostlinných roztíratelných tucích (margarínech – např. Perla, Rama, Flora), rostlinných pokrmových tucích (např. Ceres Soft, Omega) a rostlinných olejích (např. řepkový olej, slunečnicový olej, olivový olej). V případě rostlinných olejů se jedná o 100% tuk, respektive olej; 100 % tuku obsahují také rostlinné pokrmové (bílé) tuky; rostlinné roztíratelné tuky – margaríny obsahují tuk v rozmezí 20 % – 70 %. Margaríny (rostlinné roztíratelné tuky) by měly mít nulový obsah cholesterolu.
Průměrný obsah fytosterolů v margarínech je 10 – 13 g fytosterolů na 100 g, řepkový olej průměrně obsahuje 450 – 780 mg na 100 g, slunečnicový olej 240 – 450 mg na 100 g a olivový olej 100 – 200 mg na 100 g. Do některých margarínů se fytosteroly přidávají jako benefitní složky – např. Flora pro.activ.
Z předcházejících údajů je patrné, že i vzorky rostlinného původu obsahují steroly, které dokážeme prostřednictvím Liebermannova-Burchardova testu. V tomto případě lze pozorovat vznik zeleného zbarvení, ale také hnědého až červenohnědého zbarvení v případě pozitivní reakce.
Mechanismus Liebermannova-Burchardova testu:
Mechanismus této reakce je velmi složitý a vědci se jím zabývali již od začátku 20. století. Uspokojivé vysvětlení bylo podáno v 50. letech. Cholesterol v přítomnosti acetanhydridu a silné kyseliny (v našem případě koncentrované kyseliny sírové) podléhá dehydrataci, což zapřičiňuje přesun dvojné vazby v kruhu B a vznik 3,5-cholestadienu (dien – 2 dvojné vazby), který dimerizuje za vzniku bischolestadienu. Následně dochází k sulfonaci tohoto komplexu a vzniká bischolestadien monosulfonát (zelená barva). Acetanhydrid používaný v této reakci slouží tedy jako dehydratační činidlo. Postupně bylo zjištěno, že popis této reakce úplně neodpovídá skutečnosti, ačkoliv první krok se zdá být správnou úvahou.
V 70.letech byl navržen mechanismus, který byl podložen i výsledky měření absorbance. V případě Liebermannova-Burchardova testu se jedná o oxidační reakci, kdy dochází k tvorbě konjugovaných cholestapolyenů (polyen – více násobných vazeb). Barevný produkt obsahuje enylové karbokationty příslušného konjugovaného polyenu – modrozelený produkt v případě Liebermannovy-Burchardovy reakce: pentaenylový kation.
Cholesterol je oxidován v jednotlivých krocích, přičemž každá oxidace poskytující polyen má o jednu dvojnou vazbu více než předchozí sloučenina, ze které byl odvozen.
V prvním kroku dochází k protonizaci OH skupiny cholesterolu v poloze 3, následně dochází ke ztrátě vody a vzniku karbokationtu – 3,5-cholestadienu. Následuje oxidace a tvorba cholestapolyenového karbokationtu – v tomto případě pentaenylového karbokationtu, který se přeměňuje v cholestahexaen sulfonovou kyselinu.

lipidy (isoprenoidy: steroidy – cholesterol), přírodní látky (isoprenoidy: steroidy – cholesterol)

demonstrační, (laboratorní)

Varování! 

Všechny znázorněné pokusy smí provádět pouze osoby s odborným vzděláním chemického zaměření a to pouze při dodržení všech bezpečnostních pravidel a postupů a v prostorách k tomu určených. Předem je vždy nutné se důkladně seznámit s vlastnostmi jednotlivých chemických látek prostřednictvím příslušných bezpečnostních listů, s jejich nebezpečnými vlastnostmi a pokyny pro bezpečné zacházení, skladování i likvidaci. Videa mají sloužit především jako ilustrace vlastností látek, nikoliv jako návod k provedení pokusu. Jakékoliv napodobování činností na videu je pouze na vlastní nebezpečí. Poskytoval této webové stránky ani její distributoři nenesou žádnou odpovědnost za případnou újmu na zdraví či majetku, zejména pak za újmu vzniklou napodobováním v aplikaci znázorněných pokusů.

Uživatel webové stránky www.studiumchemie.cz stvrzuje, že si varování řádně přečetl a jeho obsahu porozuměl.

 

Chloroform – nebezpečný, zdraví škodlivý při požití, dráždí kůži, způsobuje vážné podráždění očí, toxický při vdechování. podezření na vyvolání rakoviny, podezření na poškození plodu v těle matky, způsobuje poškození orgánů při prodloužené nebo opakované expozici.

dle GHS:    dle staršího značení:  

1,2, – Dichlorethan – nebezpečný, zdraví škodlivý při požití, dráždí kůži, způsobuje vážné podráždění očí, může způsobit podráždění dýchacích cest, může vyvolat rakovinu, hořlavina.

dle GHS:   dle staršího značení:

Acetanhydrid – nebezpečný, způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí, zdraví škodlivý při požití nebo při vdechování, hořlavina.

dle GHS:   dle staršího značení:

Kyselina sírová – nebezpečná, způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí.

dle GHS:    dle staršího značení:  

pracujte v rukavicích, dbejte bezpečnosti při práci s organickými rozpouštědly – 1,2-dichlorethan (karcinogenní, toxický), acetanhydrid (žíravý), H₂SO₄ (žíravá)

příprava – 30 minut, vlastní provedení – 15 minut

– příprava roztoků tuků v organickém rozpouštědle: na krystalizační porcelánové misce rozpusťte kousek másla, sádla, rostlinného pokrmového tuku (Ceres Soft) a nechte chvíli škvařit, poté odeberte cca 1 ml a nakapejte jej do 20 ml nepolárního rozpouštědla (1,2-dichlorethan, chloroform), vzniklý roztok promíchejte
– vzorky másel a ztužených tuků je třeba před jejich rozpuštěním v nepolárním rozpouštědle tepelně zbavit vody (tzv. ,,přepuštění“)
– máslo (emulze vody v tuku) obsahuje minimálně 80 % tuků a cca 20 % vody, proto jej nechte škvařit déle, aby se voda vypařila – nesmí se ale přeškvařit (černé zbytky)
– pokus lze také velmi dobře provést s extraktem vaječného žloutku – viz. pokus Extrakce lipidů z vaječného žloutku, extrakt velmi snadno připravíte a zbarvení je velice intenzivní, navíc se jedná i o pokus z praktického života
– příprava roztoků olejů v nepolární rozpouštědle: 1 ml oleje přidejte k 20 ml nepolárního rozpouštědla (1,2-dichlorethan, chloroform)
– pokus lze také provést s dalšími másly i dalšími rostlinnými roztíratelnými tuky – margaríny (Perla, Flora, Rama, Hera, Stella) či rostlinnými pokrmovými tuky (Omega)
– zelené až modré zbarvení většinou poskytují zoosteroly (cholesterol) – vzorky másel, sádla
– hnědé či červenohnědé zbarvení naopak poskytují většinou fytosteroly – vzorky olejů, rostlinného pokrmového tuku
– na základě intenzity zbarvení roztoku lze kvantitativně usuzovat na obsah cholesterolu

http://www.youtube.com/watch?v=lQ3aGuIXKsY (old.studiumchemie.cz, Liebermannův-Burchardův test (Důkaz cholesterolu), video se zvukem, použity vzorky: Čerstvého másla, ,,másla s krávou“, Jihočeského másla, škvařeného sádla, rostlinného pokrmového tuku Ceres, řepkového oleje, slunečnicového oleje)
http://www.youtube.com/watch?v=wG3N7vJTdrE (old.studiumchemie.cz, Libermannův-Burchardův test 2 (Důkaz cholesterolu), video se zvukem, použit extrakt z vaječného žloutku)
http://kch.zf.jcu.cz/didaktika/biochem/index.htm (Internetová video-databáze chemických pokusů ZF JU, Organická chemie, pokus Důkaz cholesterolu – do 1:20 sušení chloroformu, do 3:47 Salkowského zkouška, do 5:18 Liebermannova-Buchardova reakce, poté do konce Formaldehydový test, video bez zvuku, někdy zdlouhavé, přehrávač Windows Media Player)