kádinka, trojnožka, azbestová síťka, kahan, sirky, kopistka, Petriho misky, tyčinka, stojan, filtrační kruh, křížová svorka, nálevka, filtrační papír, kádinka, kapátka, zkumavka, vodní lázeň (velká kádinka, trojnožka, azbestová síťka, kahan)

mléko, ocet nebo zř. HCl, Fehlingovo činidlo (Fehlingovo činidlo I – roztok CuSO4∙5H2O; Fehlingovo činidlo II – vinan sodno-draselný (Seignettova sůl), NaOH)

Do kádinky nalijte 50 ml mléka a opatrně zahřejte k varu. Obsah kádinky nechte vychladnout. Po vychladnutí odeberte z povrchu škraloup a k převařenému mléku přidejte cca 15 ml octa či 5 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové. Obsah kádinky zamíchejte tyčinkou a zfiltrujte jej. Odeberte 5 ml filtrátu do zkumavky a přidejte k němu 5 ml Fehlingova činidla. Zkumavku ponořte do vodní lázně nebo ji zahřejte nad kahanem. Část sraženiny zachycené na filtračním papíře přeneste na Petriho misku a přikapejte pár kapek Fehlingova činidla.
Po svaření mléka se na hladině objevuje škraloup. Po jeho odebrání a přidání octa nebo zředěné kyseliny chlorovodíkové k vychladlému mléku vzniká sraženina. Přefiltrováním této sraženiny získáváme bezbarvý filtrát, na filtračním papíře se zachytí bílá sraženina. Při zahřívání zkumavky obsahující bezbarvý filtrát a Fehlingovo činidlo lze pozorovat vznik oranžové sraženiny. Po nakapání Fehlingova činidla na část sraženiny zachycené na filtru se objeví fialové zbarvení.

Mléko obsahuje 5 % laktosy (mléčný cukr), 4 % bílkovin, 5 % tuku a 88 % vody. Z bílkovin má největší zastoupení (80 %) kasein, který patří mezi fosfoproteiny. Kasein je termostabilní – zvýšením teploty se nesráží. Dále jsou z bílkovin v mléce obsaženy syrovátkové bílkoviny (laktalbumin, laktoglobulin, sérový albumin). Syrovátkové proteiny se nachází v mléčném séru po vysrážení kaseinu. Tyto syrovátkové proteiny podléhají denaturaci nad 60 °C.
Při zahřívání mléka k varu dochází k denaturaci syrovátkových proteinů (tedy laktalbuminu, laktoglobulinu, sérového albuminu) – tuto denaturaci lze pozorovat jako vznik škraloupu na hladině.
Přidáním octa nebo zředěné kyseliny chlorovodíkové k vychladlému mléku dochází k vysrážení kaseinu (fosfoprotein). Kasein se v mléce shlukuje do micel, na jejichž povrchu jsou vázány ionty a hydrofilní sérové bílkoviny, které chrání vnitřní hydrofobní obsah. Snižováním pH dochází k porušování povrchových struktur kaseinových micel, tím dochází k uvolnění kaseinu a jeho denaturaci. Takto uvolněný kasein již není rozpustný, a proto tvoří sraženinu. Tento typ srážení je vratný – neutralizací mléka dojde k opětovnému rozpuštění kaseinu. Tohoto kyselého srážení kaseinu se využívá při výrobě jogurtů nebo tvarohů. V potravinářství slouží ke kyselému srážení kaseinu bakterie mléčného kvašení, které produkují kyselinu mléčnou.
Filtrací dochází k oddělení vysráženého kaseinu. Ve filtrátu lze následně dokázat přítomnost laktosy – mléčného cukru. Laktosa patří mezi disacharidy a obsahuje galaktosu a glukosu. Systematický název zní β-D-galaktopyranosyl-(1→4)-β-D-glukopyranosa. Laktosa obsahuje glykosidickou vazbu mezi 1. uhlíkem galaktosy a 4. uhlíkem glukosy. Na glukose je tedy volná hydroxylová skupina na 1. uhlíku – tzv. poloacetalový hydroxyl. Může tedy docházet k oxidaci na tomto uhlíku, a tudíž laktosa patří mezi redukující sacharidy. Laktosa se tedy oxiduje (přesněji 1. uhlík glukosy), Cu²⁺ (obsažené ve Fehlingově činidle) se redukují na oranžovou sraženinu oxidu měďného.
Po přikápnutí Fehlingova činidla ke sraženině kaseinu lze pozorovat tvorbu fialového zbarvení. Dochází k reakci mezi Cu²⁺ a peptidovou vazbou –CO–NH– za vzniku komplexu Cu²⁺ a dané bílkoviny. Vzniklý komplex je barevný – fialový.
V mléce lze tedy dokázat 3 složky – syrovátkové bílkoviny, které denaturují při teplotě nad 60 °C (škraloup). Dále lze dokázat kasein kyselým srážením (pomocí octa nebo zředěné HCl) a následně pomocí Fehlingova činidla. Provedením Biuretové reakce lze dokázat přítomnost peptidové vazby (fialové zbarvení). Laktosu přítomnou ve filtrátu lze dokázat pomocí Fehlingova činidla – laktosa je redukující disacharid, a proto redukuje Cu²⁺ na oranžovou sraženinu oxidu měďného.

sacharidy (disacharidy – důkaz laktosy), proteiny (kasein, syrovátkové proteiny)

demonstrační i laboratorní

PLACEHOLDER PRO BEZPEČNOST

Fehling I – roztok síranu měďnatého (skalice modrá) – nebezpečný, zdraví škodlivý při požití, dráždí kůži, způsobuje vážné poškození očí, vysoce toxický pro vodní organismy.

dle GHS:   dle staršího značení:     

Fehling II – vínan draselno-sodný – není nebezpečný.

  – hydroxid sodný – nebezpečný, způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí.

dle GHS:    dle staršího značení:    

 

pracujete se zředěnou HCl (žíravá), NaOH (žíravý), nepopálit se o kádinku po zahřívání mléka

příprava – 10 minut, vlastní provedení – 20 minut (celý pokus i se zahříváním mléka)

– pokus z praktického života
– mléko zahřívejte opatrně k varu – hrozí vypěnění a vytečení na azbestovou síťku (zápach spáleniny)
– v případě demonstračního pokusu je výhodné si svařit mléko předem, a poté pracovat s ochlazeným mlékem
– na vysrážení kaseinu je možné použít ocet (běžně dostupný) – pokus i názornější než se zředěnou HCl, spojení s každodenním životem
– filtrace trvá velmi dlouho
– dobré je odebrat část filtrátu a provést důkaz laktosy, kasein dokazovat tedy jako poslední až po přefiltrování
– reakce probíhající při přípravě Fehlingova činidla lze nalézt u pokusu Fehlingův test (Důkaz redukujících sacharidů)

http://www.youtube.com/watch?v=ibxTmksLIvM (old.studiumchemie.cz, Důkaz kaseinu a laktosy v mléce, video se zvukem)
http://kch.zf.jcu.cz/didaktika/biochem/index.htm (Internetová video-databáze chemických pokusů ZF JU, Biochemie, pokus Izolace kaseinu z mléka – pouze izolace bez důkazu kaseinu a laktosy, video bez zvuku, přehrávač Windows Media Player)