Portál PřF UK pro podporu výuky chemie na SŠ a ZŠ

Důkaz cholesterolu – sterolů (Liebermannův-Burchardův test)

Pomůcky

zkumavky, stojan na zkumavky, kapátka (suchá)

Chemikálie

roztoky tuků a olejů v organickém rozpouštědle (1,2-dichlorethanu, chloroformu) – máslo, sádlo, rostlinný tuk, řepkový a slunečnicový olej, extrakt z vaječného žloutku, acetanhydrid, konc. H2SO4

Postup

Připravte si roztoky tuků a olejů v organickém rozpouštědle (1,2-dichlorethan, chloroform) – koncentrace 5 %. Poté do malých zkumavek nakapejte 10 kapek roztoků tuků a olejů, případně 10 kapek extraktu vaječného žloutku. Ke každému vzorku přidejte 3 kapky acetanhydridu a 1 kapku koncentrované kyseliny sírové. Pozitivní výsledek reakce se objeví do 3 minut, maximálně do 10 minut – zbarvení může být od červené – hnědé – modré – zelené (nějčastěji zelené, modré či hnědé).
Výsledné zbarvení v případě roztoků másel (Čerstvé máslo, ,,máslo s krávou“, Jihočeské máslo) je zelené – nejintenzivnější je u ,,másla s krávou“. Sádlo většinou neposkytuje charakteristické zelené zbarvení – výsledný roztok je bezbarvý či slabě zelený. Rostlinný pokrmový tuk dává nahnědlé zbarvení roztoku, slunečnicový a řepkový olej poskytují hnědozelené až tmavě zelené zbarvení roztoků. V případě extraktu vaječného žloutku lze pozorovat modré zbarvení, které přechází do tmavě zelené.

Princip

Cholesterol je 27 uhlíkatá látka, která patří do skupiny steroidů (odvozené lipidy – isoprenoidy). Jeho základem je struktura steranu – cyklopentanoperhydrofenanthren. Cholesterol obsahuje v kruhu B dvojnou vazbu a –OH skupinu v poloze 3 na kruhu A – řadí se tedy do skupiny sterolů (steroidních alkoholů). Cholesterol je velice důležitý pro syntézu steroidních hormonů, žlučových kyselin a vitaminu D.

Liebermannův-Burchardův test dokazuje přítomnost cholesterolu, případně i dalších sterolů (fytosterolů) ve vzorcích tuků a olejů. Pozitivním výsledkem reakce je vznik zeleného, modrého, případně hnědého až červeného zbarvení. Vznik zeleného zbarvení při reakcích v přítomnosti cholesterolu je způsoben narušením cyklopentanoperhydrofenanthrenového skeletu molekuly a vznikem specifického produktu, který se projevuje právě zeleným zbarvením. Při vysoké koncentraci cholesterolu přechází zbarvení v temně zelené až tmavě modré (např. v případě vaječného žloutku). Hnědé zbarvení se většinou objevuje v případě důkazů fytosterolů v rostlinných tucích a olejích. Tento test tedy není specifický pouze na cholesterol.
Cholesterol (zoosterol – sterol živočišného původu) je obsažen jak v másle, tak i sádle i ve vaječném žloutku. Jako máslo lze definovat výrobek, který obsahuje minimálně 80 % tuků (většinou se průměrný obsah tuků pohybuje okolo 82 %). Máslo obsahuje cca 16 % vody – jedná se tedy o emulzi vody v tuku. Máslo obsahuje také cholesterol, který lze dokázat pomocí Liebermannova-Burchardova testu, a to průměrně 250 mg na 100 g másla. Oproti tomu sádlo je 100% tuk a obsahuje cca 1/3 cholesterolu v porovnání s máslem – průměrný obsah cholesterolu v sádle je cca 95 mg na 100 g sádla. Z tohoto důvodu má vzniklé zbarvení menší intenzitu u sádla než u másla (některá másla ovšem také neposkytují výrazné zelené zbarvení – neobsahují tedy velké množství cholesterolu). Vaječný žloutek obsahuje průměrně 1 120 mg cholesterolu na 100 g vaječného žloutku. Cholesterol je tedy významnou součástí vaječného žloutku, proto v extraktu cholesterol dokážeme vznikem tmavě zeleného až modrého zbarvení.
Fytosteroly (steroly rostlinného původu) se nachází v rostlinných roztíratelných tucích (margarínech – např. Perla, Rama, Flora), rostlinných pokrmových tucích (např. Ceres Soft, Omega) a rostlinných olejích (např. řepkový olej, slunečnicový olej, olivový olej). V případě rostlinných olejů se jedná o 100% tuk, respektive olej; 100 % tuku obsahují také rostlinné pokrmové (bílé) tuky; rostlinné roztíratelné tuky – margaríny obsahují tuk v rozmezí 20 % – 70 %. Margaríny (rostlinné roztíratelné tuky) by měly mít nulový obsah cholesterolu.
Průměrný obsah fytosterolů v margarínech je 10 – 13 g fytosterolů na 100 g, řepkový olej průměrně obsahuje 450 – 780 mg na 100 g, slunečnicový olej 240 – 450 mg na 100 g a olivový olej 100 – 200 mg na 100 g. Do některých margarínů se fytosteroly přidávají jako benefitní složky – např. Flora pro.activ.
Z předcházejících údajů je patrné, že i vzorky rostlinného původu obsahují steroly, které dokážeme prostřednictvím Liebermannova-Burchardova testu. V tomto případě lze pozorovat vznik zeleného zbarvení, ale také hnědého až červenohnědého zbarvení v případě pozitivní reakce.
Mechanismus Liebermannova-Burchardova testu:
Mechanismus této reakce je velmi složitý a vědci se jím zabývali již od začátku 20. století. Uspokojivé vysvětlení bylo podáno v 50. letech. Cholesterol v přítomnosti acetanhydridu a silné kyseliny (v našem případě koncentrované kyseliny sírové) podléhá dehydrataci, což zapřičiňuje přesun dvojné vazby v kruhu B a vznik 3,5-cholestadienu (dien – 2 dvojné vazby), který dimerizuje za vzniku bischolestadienu. Následně dochází k sulfonaci tohoto komplexu a vzniká bischolestadien monosulfonát (zelená barva). Acetanhydrid používaný v této reakci slouží tedy jako dehydratační činidlo. Postupně bylo zjištěno, že popis této reakce úplně neodpovídá skutečnosti, ačkoliv první krok se zdá být správnou úvahou.
V 70.letech byl navržen mechanismus, který byl podložen i výsledky měření absorbance. V případě Liebermannova-Burchardova testu se jedná o oxidační reakci, kdy dochází k tvorbě konjugovaných cholestapolyenů (polyen – více násobných vazeb). Barevný produkt obsahuje enylové karbokationty příslušného konjugovaného polyenu – modrozelený produkt v případě Liebermannovy-Burchardovy reakce: pentaenylový kation.
Cholesterol je oxidován v jednotlivých krocích, přičemž každá oxidace poskytující polyen má o jednu dvojnou vazbu více než předchozí sloučenina, ze které byl odvozen.
V prvním kroku dochází k protonizaci OH skupiny cholesterolu v poloze 3, následně dochází ke ztrátě vody a vzniku karbokationtu – 3,5-cholestadienu. Následuje oxidace a tvorba cholestapolyenového karbokationtu – v tomto případě pentaenylového karbokationtu, který se přeměňuje v cholestahexaen sulfonovou kyselinu.

Využití

lipidy (isoprenoidy: steroidy – cholesterol), přírodní látky (isoprenoidy: steroidy – cholesterol)

Typ pokusu

demonstrační, (laboratorní)

Bezpečnost

pracujte v rukavicích, dbejte bezpečnosti při práci s organickými rozpouštědly – 1,2-dichlorethan (karcinogenní, toxický), acetanhydrid (žíravý), H2SO4 (žíravá)

Čas

příprava – 30 minut, vlastní provedení – 15 minut

Tipy

– příprava roztoků tuků v organickém rozpouštědle: na krystalizační porcelánové misce rozpusťte kousek másla, sádla, rostlinného pokrmového tuku (Ceres Soft) a nechte chvíli škvařit, poté odeberte cca 1 ml a nakapejte jej do 20 ml nepolárního rozpouštědla (1,2-dichlorethan, chloroform), vzniklý roztok promíchejte
– vzorky másel a ztužených tuků je třeba před jejich rozpuštěním v nepolárním rozpouštědle tepelně zbavit vody (tzv. ,,přepuštění“)
– máslo (emulze vody v tuku) obsahuje minimálně 80 % tuků a cca 20 % vody, proto jej nechte škvařit déle, aby se voda vypařila – nesmí se ale přeškvařit (černé zbytky)
– pokus lze také velmi dobře provést s extraktem vaječného žloutku – viz. pokus Extrakce lipidů z vaječného žloutku, extrakt velmi snadno připravíte a zbarvení je velice intenzivní, navíc se jedná i o pokus z praktického života
– příprava roztoků olejů v nepolární rozpouštědle: 1 ml oleje přidejte k 20 ml nepolárního rozpouštědla (1,2-dichlorethan, chloroform)
– pokus lze také provést s dalšími másly i dalšími rostlinnými roztíratelnými tuky – margaríny (Perla, Flora, Rama, Hera, Stella) či rostlinnými pokrmovými tuky (Omega)
– zelené až modré zbarvení většinou poskytují zoosteroly (cholesterol) – vzorky másel, sádla
– hnědé či červenohnědé zbarvení naopak poskytují většinou fytosteroly – vzorky olejů, rostlinného pokrmového tuku
– na základě intenzity zbarvení roztoku lze kvantitativně usuzovat na obsah cholesterolu

Video

http://www.youtube.com/watch?v=lQ3aGuIXKsY (old.studiumchemie.cz, Liebermannův-Burchardův test (Důkaz cholesterolu), video se zvukem, použity vzorky: Čerstvého másla, ,,másla s krávou“, Jihočeského másla, škvařeného sádla, rostlinného pokrmového tuku Ceres, řepkového oleje, slunečnicového oleje)
http://www.youtube.com/watch?v=wG3N7vJTdrE (old.studiumchemie.cz, Libermannův-Burchardův test 2 (Důkaz cholesterolu), video se zvukem, použit extrakt z vaječného žloutku)
http://kch.zf.jcu.cz/didaktika/biochem/index.htm (Internetová video-databáze chemických pokusů ZF JU, Organická chemie, pokus Důkaz cholesterolu – do 1:20 sušení chloroformu, do 3:47 Salkowského zkouška, do 5:18 Liebermannova-Buchardova reakce, poté do konce Formaldehydový test, video bez zvuku, někdy zdlouhavé, přehrávač Windows Media Player)