Portál PřF UK pro podporu výuky chemie na SŠ a ZŠ

Denaturace proteinů

Pomůcky

kádinka, zkumavky, stojánek na zkumavky, zátky, kapátka, trojnožka, azbestová síťka, kahan, sirky, kádinka (1 000 ml), (teploměr)

Chemikálie

vaječný bílek, 0,5% NaCl, roztok CuSO4, nasycený roztok (NH4)2SO4, konc. HCl, aceton, destilovaná voda

Postup

Připravte si roztok bílkoviny – vaječný bílek zřeďte 0,5% roztokem chloridu sodného v poměru 1:1. Nalijte asi 2 ml roztoku do 5 zkumavek. Do první zkumavky přikápněte roztok síranu měďnatého, do druhé nasycený roztok síranu amonného, do třetí zkumavky přidejte koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou a do čtvrté zkumavky přikapávejte aceton. Roztok ve druhé zkumavce (s nasyceným roztokem síranu amonného) zřeďte vodou. Poslední zkumavku ponořte do vodní lázně a zahřívejte ji ve vroucí lázni.
Ve všech 4 zkumavkách se po přikápnutí příslušného činidla objevuje bílá sraženina, v první zkumavce lze pozorovat modré zbarvení síranu měďnatého. Ve druhé zkumavce (s nasyceným roztokem síranu amonného) po naředění vodou dochází k rozpuštění sraženiny a vyčeření. V poslední páté zkumavce dojde také ke vzniku sraženiny při cca 65 °C.

Princip

Hlavní složkou vaječného bílku je bílkovina ovalbumin, který obsahuje všechny esenciální aminokyseliny. Ovalbumin je dobře rozpustný ve vodě a obsahuje ve své sekundární struktuře α-šroubovice i β-skládané listy.
Při přidávání síranu měďnatého, koncentrované kyseliny chlorovodíkové a acetonu dochází k porušení terciární a sekundární struktury bílkovin – primární struktura (peptidové vazby se neštěpí) zůstává zachována. Porušením intramolekulárních vazebných interakcí (vodíkové můstky, disulfidické můstky, iontové vazby, van der Waalsovy síly) dochází k tomu, že se neuspořádané polypeptidové řetězce denaturovaných molekul bílkovin shlukují a tvoří sraženinu. Je to způsobeno tím, že se díky denaturaci dostávají na povrch hydrofobní části polypeptidových řetězců, které raději interagují spolu než s vodou. Po přidání vody ke sraženině se sraženina nerozpustí. Denaturace je tedy nevratný proces, při kterém bílkoviny ztrácí jednak svou prostorovou strukturu, ale i funkci. Jedná se tedy o ireversibilní (nevratnou denaturaci).
Ke stejnému jevu dochází i v případě zahřívání bílkoviny ve vroucí lázni. Při určité teplotě – cca 65 °C dochází ke vzniku sraženiny, denaturaci. Tohoto jevu se využívá v praktickém životě – vaření vajíček.
Ireversibilní (nevratnou) denaturaci lze obecně provést přidáním solí těžkých kovů, kyselin, organických rozpouštědel či ji lze provést za zvýšené teploty.
V případě nasyceného roztoku síranu amonného lze pozorovat také vznik sraženiny, která se ovšem v nadbytku vody rozpouští. Molekuly ovalbuminu jsou totiž solvatovány – obklopeny molekulami vody. Po přidání síranu amoného do roztoku bílkoviny dochází k jeho rozkladu na ionty – amonné kationty a síranové anionty. Molekuly vody poté ovšem přednostně solvatují právě tyto ionty, tudíž nakonec nezbude téměř žádná voda pro molekuly ovalbuminu. Molekuly ovalbuminu se shlukují k sobě a tvoří sraženinu (vysolují se). Zde je již vidět odlišný princip vzniku sraženiny – zde nedochází k porušení terciární a sekundární struktury, pouze mizí solvatační obal molekul bílkovin.
Po přidání vody se sraženina rozpustila – přidáním molekul vody došlo opět k solvataci molekul ovalbuminu. Tento proces se tedy nazývá vysolování (někdy nesprávně označován jako reversibilní (vratná) denaturace), kdy dochází k vratnému vysrážení molekul ovalbuminu, jejichž prostorová struktura i funkce zůstávají zachovány.

Využití

proteiny (denaturace – ireversibilní, vysolování)

Typ pokusu

demonstrační i laboratorní

Bezpečnost

pozor při práci s koncentrovanou HCl (žíravá), acetonem (vysoce hořlavý) – pracujte v rukavicích

Čas

příprava – 10 minut, vlastní provedení – 10 minut

Tipy

– roztok bílkoviny – můžete použít samotný vaječný bílek, je s ním ale horší manipulace, popřípadě použijte naředění 0,5% roztokem NaCl
– ředění vodou (z vodovodu, destilovanou) není moc dobré – dochází k částečnému vysrážení (toto ředění ale možno využít u pokusů na důkaz dusíku nebo síry – zde pokusy fungují), v tomto pokusu není moc vhodné
– je nutné použít nasycený roztok (NH4)2SO4 – s ním dochází k vytvoření sraženiny, se zředěným pokus nefunguje
– s ostatními činidly pokus probíhá dobře

Video

https://www.youtube.com/watch?v=KQIfNx-0N5g (old.studiumchemie.cz, Denaturace bílkovin, video bez zvuku)
https://www.youtube.com/watch?v=b6fda4l3I3A (old.studiumchemie.cz, Denaturace bílkovin teplotou, video bez zvuku)
Denaturace proteinů – nevratná denaturace acetonem (vaječný bílek + aceton, animace ve flash, s vysvětlením v podobě textu po obrázky)
Denaturace proteinů – vratná denaturace (vaječný bílek + síran amonný, animace ve flash, s vysvětlením v podobě textu pod obrázky)
http://www.youtube.com/watch?v=o2ju5ys3Cxc (Chemistry – Denaturation of Protein by Strong Acid, vaječný bílek + silná kyselina, s anglickým komentářem)
http://kch.zf.jcu.cz/didaktika/biochem/index.htm (Internetová video-databáze chemických pokusů ZF JU, Biochemie, pokus Denaturace bílkovin varem – porovnání mléka a vaječného bílku, video bez zvuku, přehrávač Windows Media Player)
http://kch.zf.jcu.cz/didaktika/biochem/index.htm (Internetová video-databáze chemických pokusů ZF JU, Biochemie, pokus Srážecí reakce bílkovin – vaječný bílek + (CH3COO)2Pb, (NH4)2SO4, ethanol, taninový roztok; video bez zvuku, přehrávač Windows Media Player)
http://www.youtube.com/watch?v=6GslH2vhzGQ (High Tea and denaturing proteins!! How do they link?, video s praktickým přesahem: čaj s mlékem)
http://www.youtube.com/watch?v=0XpYX4TsohM (Protein Denaturation (Egg White), denaturace – porovnání různých pH, video s hudebním doprovodem, s anglickými titulky)